Em todas as situações em que houver indicação de reprodução assistida (RA), seja de baixa complexidade (ex.: inseminação artificial) ou de alta complexidade (ex.: fertilização in vitro (FIV), com ou sem micromanipulação de gametas), deve-se realizar o processamento dos espermatozóides no laboratório, para separar os gametas viáveis, remover toxinas e contaminantes, ou para melhorar o potencial fértil. Para desempenhar bem o seu papel, o laboratório deve:

1) obter a amostra de sêmen (ou de gametas) com a melhor qualidade possível,

2) minimizar o dano celular iatrogênico durante o tratamento, e

3) melhorar a capacidade funcional do espermatozóide.

Fatores intrínsecos do indivíduo

O laboratório deve ser informado se o indivíduo está ou esteve exposto a substâncias ou a estados de saúde que sabidamente interferem na espermatogênese, por causa da possibilidade de alteração na qualidade da amostra obtida. A coleta da amostra de sêmen deve obedecer a um período de abstinência sexual de dois a três dias.

Dano iatrogênico ao espermatozóide no laboratório

Para fins de tratamento do sêmen no laboratório, recomenda-se que os espermatozóides sejam removidos do plasma seminal entre 30 e 60 minutos após a coleta.

Microrganismos danificam os espermatozóides por ação direta (lesão da membrana plasmática) ou indireta (aumento de leucócitos, com conseqüente aceleração da produção de espécies ativas de oxigênio). A amostra deve ser, portanto, essencialmente livre de contaminantes, como bactérias, fungos e vírus. A assepsia do laboratório é importante para evitar a contaminação durante as técnicas de processamento do sêmen. Os materiais utilizados no laboratório devem ser o mais bioquimicamente inerte possível (vidro neutro, como borissilicato; plásticos de polipropileno ou de poliestireno), descartáveis, de origem conhecida e testados quanto à toxicidade celular. O uso de luvas deve seguir controle criterioso. Recomenda-se lavá-las com água estéril e evitar o toque nas superfícies com as quais a amostra entrará em contato direto, pois as luvas são compostas de material com efeito citotóxico. Deve-se dar preferência aos meios de cultura prontos para uso e pré-testados quanto à toxicidade (HTF ou BWW [Irvine], Sperm Buffer ou Sperm Medium [Cook], Gamete [Vitrolife], HF10, Tyrode’s etc.). A adição de uma fonte protéica, como a albumina, nos meios não-suplementados, confere proteção adicional ao espermatozóide. Deve-se evitar exposição do sêmen a baixas temperaturas (abaixo de 20ºC), luz ultravioleta, radiação ionizante e eletromagnética, por seus efeitos sobre a motilidade, produção de radicais livres e estrutura do DNA do espermatozóide.

Coleta da amostra

O método ideal para a coleta da amostra de sêmen é a masturbação, numa sala apropriada anexa ao laboratório, e em frasco de boca larga de material atóxico, conforme descrição anterior. A coleta domiciliar segue as mesmas orientações, porém a chegada da amostra ao laboratório não deve ultrapassar 60 minutos. Situações especiais podem ser contornadas, como a coleta durante o coito utilizando-se preservativos atóxicos (ex. Male Factor Pak); a vibroestimulação ou a eletroejaculação, em indivíduos com lesão raquimedulares; e, na ejaculação retrógrada, minimiza-se a toxicidade urinária pela da alcalinização, diluição urinária e diminuição do tempo de contato do espermatozóide com a urina.

A hiperviscosidade do plasma seminal pode ser minimizada pela diluição em meio de cultura e pipetagem sucessiva, ou, nos casos mais graves, pela adição de enzimas proteolíticas (alfa-quimotripsina tipo IV-S, Sigma). A prática comum da passagem do sêmen hiperviscoso por agulha fina deve ser abandonada, pois causa dano celular.

Em situações cuja amostra inicial não preencheu os pré-requisitos para sua utilização associada à técnica de RA indicada, uma segunda coleta poderá ser solicitada a fim de otimizar o resultado do processamento final antes do emprego de uma técnica de RA mais complexa.

No caso de ejaculados azoospérmicos, indica-se a centrifugação da amostra para exame cuidadoso do sedimento, cuja finalidade é isolar espermatozóides de indivíduos com criptozoospermia, possibilitando assim o uso destes para técnicas de RA de alta complexidade, evitando-se técnicas invasivas de obtenção do gameta do epidídimo ou testículo.

Diluição e lavagem seminal

As técnicas de preparo do sêmen, em geral, possuem etapas que envolvem diluição e centrifugação que, embora necessárias, danificam os espermatozóides (dano subletal). Para minimizar esse dano, recomenda-se:

1) utilizar meio de cultura de qualidade, com suplementação protéica e aquecido a 37ºC;

2) utilizar força de centrifugação entre 200 e 400Xg;

3) evitar múltiplas centrifugações e centrifugação por tempo prolongado (acima de 30 minutos).

A diluição, com meio de cultura, e a separação dos espermatozóides do plasma seminal, por centrifugação, constituem o método mais simples e rápido para o preparo do sêmen. A grande desvantagem é que todos os espermatozóides da amostra original, incluindo os anormais e os mortos, além de outros elementos (leucócitos, células germinativas e epiteliais, debris), permanecem no produto final e, conseqüentemente, causam diminuição da capacidade funcional e da longevidade dos espermatozóides móveis. Recomenda-se, portanto, que tal técnica seja evitada em favor de outras, que, quando disponíveis, selecionam apenas a fração móvel dos espermatozóides móveis (veja a seguir). Exceção a essa regra pode ser aplicada ao sêmen criopreservado, cujos espermatozóides possuem menor longevidade e maior fragilidade do que aqueles frescos, e o preparo mais elaborado poderia danificá-los ainda mais.

Métodos para selecionar espermatozóides móveis para reprodução assistida

As técnicas de “swim-up” e do gradiente descontínuo coloidal são, de longe, as mais utilizadas para o processamento do sêmen para RA. Não devem ser consideradas técnicas de capacitação espermática, mas sim de processamento seletivo do sêmen, pois não são capazes de induzir as modificações estruturais e bioquímicas que ocorrem no fenômeno da capacitação. Tais técnicas, quando realizadas antecedendo a RA, têm finalidade prognóstica (processamento seletivo prognóstico), pois avaliam o número de espermatozóides móveis recuperados e auxiliam na definição da técnica de RA a ser utilizada (capítulo 8).

Técnica de migração ascendente (“swim-up”)

Baseia-se na velocidade de progressão direcional dos espermatozóides.

Elimina o plasma seminal, debris, material amorfo, células esfoliativas, espermatozóides mortos, imóveis e aqueles sem velocidade de progressão direcional. Ao final, obtém-se uma amostra limpa contendo espermatozóides que exibem excelente motilidade. A técnica de “swim-up” recupera cerca de 20% dos espermatozóides móveis presentes no ejaculado inicial. Daí advém sua principal limitação, ou seja, a baixa recuperação, principalmente se o sêmen estiver sendo preparado para IA, na qual um número elevado de espermatozóides móveis são necessários, ou a partir de amostras oligoastenozoospérmicas, nas quais a concentração inicial de espermatozóides móveis é baixa.

Centrifugação através de gradientes coloidais

Baseia-se na aplicação de uma força centrífuga sobre os espermatozóides e outros elementos particulados do sêmen, obrigando-os a vencer gradientes de densidades diferentes.  Este método é mais rápido e geralmente recupera maior proporção de espermatozóides móveis do que a técnica de migração ascendente em todos os tipos de infertilidade masculina. Entretanto, a qualidade final da motilidade é inferior àquela obtida com o “swim-up”. Para a preparação dos gradientes, a substância mais utilizada atualmente é a sílica estabilizada com silano hidrofílico, em substituição ao Percoll, que foi retirado do mercado americano em 1996. Esses gradientes são encontrados prontos para uso sob diferentes nomes comerciais (Isolate, PureSperm, Enhance Splus), cuja qualidade e eficácia são comparáveis. O número de gradientes geralmente varia de 2 a 3, e o volume destes, de 0,3 a 2,0 ml, conforme as variáveis do sêmen. A centrifugação através de gradientes é a técnica mais indicada para processar amostras de sêmen com leucocitospermia, pois minimiza a chance de contaminação bacteriana no produto final.

Substâncias estimulantes

É possível melhorar a capacidade funcional dos espermatozóides pelo uso de estimulantes. Dentre todas as substâncias estudadas e testadas clinicamente, a pentoxifilina (PF) é a que oferece os maiores benefícios. A PF inibe a fosfodiesterase, enzima responsável pela degradação da adenosina monofosfato cíclica (AMPc). Conseqüentemente, há elevação na concentração intracelular de AMPc, que, além de ser o regulador primário da motilidade do axonema da cauda do espermatozóide, atua como segundo mensageiro no mecanismo de reação acrossômica.

O uso da pentoxifilina no preparo do sêmen para RA melhora a motilidade espermática e otimiza a capacidade do espermatozóide sofrer reação acrossômica em resposta a estímulos artificiais ou fisiológicos. Além disso, a PF também atua como antioxidante, impedindo a formação de radicais livres do oxigênio (ROS). Os melhores resultados são obtidos com as amostras oligo/astenozoospérmicas. No entanto, a resposta à PF varia individualmente, sendo necessário testar previamente sua eficácia. A PF é geralmente utilizada de duas maneiras:

1. adicionada diretamente ao ejaculado, na dose de 5 mM, ou

2. adicionada aos espermatozóides selecionados na dose de 3,6 mM.

Em ambos os casos, o tempo de exposição à PF deve situar-se entre 30 e 40 minutos, sendo mandatória a remoção completa da droga antes da IA ou FIV convencional. No primeiro caso, o intuito é aumentar a motilidade espermática e a capacidade antioxidante do sêmen, visando obter um número maior de espermatozóides recuperados e com capacidade funcional superior no final do preparo da amostra. Tal sistemática é benéfica para:

1) indivíduos com oligoastenozoospermia envolvidos em programas de IA ou FIV,

2) amostras obtidas por vibroestimulação ou eletroejaculação,

3) amostras criopreservadas.

No segundo caso, o objetivo é aumentar as taxas de fertilização in vitro, principalmente nos casos de falha prévia de fertilização devido ao fator masculino.

Infertilidade imunológica

Em determinadas situações, o laboratório receberá ejaculados com níveis elevados de anticorpos antiespermatozóides (exemplo: após reversão de vasectomia e processos que romperam a barreira hematotesticular). Nesses casos, a amostra deve ser coletada diretamente num frasco já contendo meio de cultura, com o intuito de diluir os títulos de anticorpos, sendo fundamental o processamento imediato da mesma. As taxas de gravidez após IA ou FIV com amostras contendo mais de 50% de espermatozóides com anticorpos ligados a sua superfície são baixas. Nesses casos, a ICSI oferece melhores resultados.

Processamento do material obtido do epidídimo e do testículo

Devido ao número reduzido e à diminuição do potencial fértil dos gametas obtidos do epidídimo e do testículo, indica-se a ICSI nestes casos. O papel do laboratório é o de selecionar e isolar os melhores gametas, separando-os de debris, elementos celulares do tecido de origem, hemácias e espermatozóides anormais. Nos aspirados do epidídimo, em geral, o material é processado por diluição com meio de cultura, centrifugação e ressuspensão, podendo-se utilizar a passagem por gradientes coloidais de pequeno volume (quadro 2). No caso da extração de espermatozoides do parênquima testicular, inicialmente é importante remover o sangue do material. Para tanto, lava-se exaustivamente os fragmentos do parênquima testicular com meio de cultura.

A seguir, realiza-se a dissecção do tecido, já imerso no meio de cultura, com auxílio de material microcirúrgico, agulhas ou lâminas de microscopia, com o intuito de desprender os gametas existentes no interior dos túbulos seminíferos.  O líquido contendo o parênquima testicular macerado é centrifugado e o sedimento resultante é ressuspendido com meio de cultura. Nos casos onde há grande quantidade de hemácias, pode-se realizar a lise das mesmas com solução hemolisante. Pode-se ainda empregar a colagenase, que dissolve as fibras colágenas dos túbulos seminíferos, e facilita a identificação dos gametas.

O material resultante é colocado numa placa de Petri, na forma de microgotas, recobertas com óleo mineral, para que se proceda a identificação e isolamento dos gametas para a ICSI, utilizando microscópio invertido com contraste de fase, equipado com micromanipuladores. A ICSI é geralmente realizada a partir de espermatozóides morfologicamente normais e móveis, utilizados como parâmetros de potencial fértil e vitalidade. A presença unicamente de espermatozóides imóveis ao final do processamento implicará uma etapa adicional para seleção do gameta viável para ICSI, que pode ser realizada por técnicas diversas, dentre elas a técnica da solução hipoosmótica. Imediatamente antes da ICSI, o espermatozóide é ativado por ruptura da sua membrana plasmática, utilizando-se a ultracentrifugação ou a “quebra” da cauda com a micropipeta de injeção. Esta última também é importante para a imobilização do gameta, etapa fundamental no processo da ICSI.

Uso de espermátides e maturação do gameta masculino no laboratório

A ausência de espermatozóides maduros implicará na possibilidade da utilização de células imaturas (somente espermátides alongadas ou em alongamento) associadas a ICSI. Os resultados de fertilização e gravidez com o uso de espermátides alongadas ou em alongamento tem sido satisfatórios, embora inferiores àqueles obtidos com espermatozóides. Atualmente, a utilização de espermátides redondas não é indicada, uma vez que existem pouquíssimos relatos de fertilização e gravidez.

A maturação de espermátides alongadas e espermatozóides testiculares no laboratório tem recebido muita atenção, porém os resultados ainda são limitados. Neste processo, os gametas são mantidos em cultura por dois a três dias. Substâncias como a testosterona, o FSH e o LH têm sido adicionadas à cultura com resultados variáveis. O objetivo final é a obtenção de espermatozóides móveis. Nos casos de maturação in vitro, deve-se obter o material testicular previamente à coleta oocitária. A maturação de espermátides redondas, espermatócitos e espermatogônias encontram-se, atualmente, em nível experimental.

Conclusão

O grande avanço no tratamento da infertilidade masculina nos últimos tempos foi obtido no laboratório. A integração clínico-laboratorial é fundamental para o uso correto das técnicas de preparo do sêmen, objetivando assim a melhora da capacidade funcional dos espermatozóides. Isto possibilita, em várias situações, o emprego de técnicas de RA menos invasivas, complexas e onerosas. Mesmo quando a fertilização in vitro associada à micromanipulação de gametas está indicada, o preparo adequado do sêmen é fundamental para selecionar os melhores gametas e remover debris, elementos celulares, espermatozóides mortos e imóveis. A partir de uma amostra limpa e composta por espermatozóides móveis, torna-se mais fácil e rápido imobilizar, aspirar e injetar o espermatozóide no oócito, além de evitar a contaminação e a obstrução da micropipeta de injeção com células ou debris. Por fim, a perspectiva de maturar, no laboratório, o gameta masculino, traz esperanças para homens até há muito pouco tempo considerados estéreis.