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Investigação

Testes de função espermática

 

 

Não é o número absoluto de espermatozóides que prediz o prognóstico de fertilidade, mas, sim, a sua capacidade funcional. Apenas as provas de função espermática podem dar informações referentes à probabilidade de um homem vir a engravidar a sua parceira.  Alguns destes testes, como a avaliação das Espécies Reativas de Oxigênio, estão sendo rotineiramente realizados por alguns laboratórios americanos nos pacientes com queixas de infertilidade. Estes testes podem auxiliar na indicação de cirurgias para infertilidade masculina, até ajudar a escolher a técnica mais apropriada para reprodução assistida, com uma boa relação custo-benefício.

 

Teste do edema hiposmótico (HOS)

O teste do edema hiposmótico é um teste de vitalidade espermática. O objetivo deste teste é avaliar a capacidade dos espermatozóides de sofrerem edema na cauda quando colocados em uma solução hiposmótica. Este teste deve ser solicitado quando o paciente apresenta uma astenozoospermia importante (motilidade espermática inferior a 30%). Quando mais de 60% dos espermatozóides apresentam edema de cauda é considerado resultado normal. Estudos demonstram que o teste de HOS é fidedigno apenas quando avaliamos sêmen fresco e não amostras criopreservadas. Este teste tem sido utilizado para identificar o melhor espermatozóide para ser injetado em procedimentos de ICSI, onde a amostra tem espermatozóides imóveis ou provenientes de pacientes com azoospermia não-obstrutiva.

 

Teste da creatina-quinase (CK)

A CK pode ser considerada uma enzima-chave na produção e utilização de energia nas células porque facilita a manutenção de níveis intracelulares de ATP. Os níveis de CK correlacionam-se positivamente com o grau de oligozoospermia, independentemente do diagnóstico clínico da infertilidade, sendo, desta forma, considerada um indicador mais sensível da qualidade seminal e maturidade dos espermatozóides. Altos níveis de CK são inversamente relacionados ao potencial de fertilização do espermatozóide, indicando seu grau de maturação celular.

 

Possivelmente, esta enzima pode ser utilizada para uma indicação cirúrgica e acompanhar pacientes tratados por problemas de infertilidade masculina. Nestas circunstâncias, ela poderia ser útil para indicar cirurgia de correção de varicocele em pacientes com qualidade seminal limítrofe para normalidade ou no adolescente solteiro que tem uma varicocele sem ainda ter manifestações laboratoriais ou clínicas de infertilidade.

 

Espécies Reativas de Oxigênio (ROS) – Peroxidação Lipídica

Os leucócitos são considerados a principal fonte produtora de Espécies Reativas de Oxigênio no plasma seminal. Apenas um leucócito polimorfonuclear é capaz de produzir 1.000 a 10.000 vezes mais ROS comparado a qualquer tipo de célula da linhagem germinativa, podendo causar diminuição na motilidade espermática e capacidade de penetração oocitária.

As membranas celulares estão sujeitas ao ataque das ROS por possuírem grande conteúdo de ácidos graxos poliinsaturados nos fosfolipídios, os quais são particularmente sensíveis a reações oxidativas, promovendo o fenômeno da Peroxidação Lipídica (LPO), a qual está geralmente associada com uma diminuição da função e viabilidade espermática.  Com a LPO, existe uma perda na fluidez da membrana espermática, prejudicando o bom funcionamento de espermatozóide, a motilidade espermática e a sua fusão com o oócito.

 

Teste da Capacidade Antioxidante Total (CATS)

Antioxidantes são substâncias, moléculas ou enzimas que inibem, impedem ou bloqueiam as ações deletérias promovidas pelas ROS.

Dentre os antioxidantes mais comuns destacam-se as vitaminas C, E, a glutationa e a pentoxifilina. O papel desempenhado pela vitamina E usada em pacientes com infertilidade permanece contraditório. Entretanto, pesquisadores encontraram aumento na motilidade espermática e taxas de gravidez, comprovando que a terapia com vitamina E pode ser usada em alguns grupos de homens inférteis.

O ácido ascórbico (vitamina C) reduz e, em alguns casos, até previne a oxidação de moléculas biológicas. Entretanto, alguns estudiosos não observaram melhora nos parâmetros seminais ao usarem altas doses de vitaminas C e E em estudos duplo-cego placebo-controlado.

Logo, os antioxidantes talvez sejam benéficos apenas nos casos de infertilidade, onde a etiologia é o Estresse Oxidativo.

 

Citoquinas

Pesquisas recentes demonstraram que o sêmen humano contém: fator-α de necrose tumoral (TNF- α), fator de crescimento (TGF), várias interleucinas (IL’s), vários receptores solúveis para interleucinas (srIL), e antagonistas dos receptores das interleucinas (Ilra).

 

In vitro, as citoquinas diminuem a motilidade espermática, aumentam a produção de ROS nos espermatozóides e diminuem a habilidade do espermatozóide em penetrar no oócito. Estudos in vivo não foram capazes de demonstrar uma correlação direta entre citoquinas e concentração espermática, motilidade e morfologia. Entretanto, alguns estudos demonstraram uma correlação direta entre concentrações elevadas de citoquinas no plasma seminal e diminuição da fertilidade.

 

Testes de Interação dos Espermatozóides com o Muco Cervical

A deficiência na passagem dos espermatozóides pelo muco cervical é causa de infertilidade em 10% dos casais. O Teste Pós-Coital (TPC) é o teste mais empregado para avaliar a interação do sêmen com o muco cervical. O TPC é normal quando se encontram 20 ou mais espermatozóides móveis por campo. Um teste anormal resulta mais comumente de um tempo inapropriado de coito. Outras causas incluem anticorpo anti-espermatozóide, anovulação, alterações hormonais, infecções do trato genital, baixa qualidade espermática e disfunção sexual masculina.

 

Como o TPC baseia-se muito em fatores que estão além do controle do clínico, e a interpretação do TPC sofre grandes variações dependendo de quem o faz, a utilidade do teste pós-coito na investigação de infertilidade tem sido questionada. O TPC sempre suscitou dúvidas sobre a limitada correlação com fertilidade, inabilidade de estabelecer uma padronização sobre os valores da normalidade e controvérsias a respeito do tratamento apropriado de um resultado anormal para o TPC.

Testes de interação dos espermatozóides com o muco bovino podem ser feitos in vitro com testes comerciais disponíveis no mercado: Penetrak e Tru-Trax.

 

Teste de Reação Acrossômica

A reação acrossômica é um fenômeno biológico que ocorre no trato reprodutivo feminino após o fenômeno de capacitação. Esses processos podem ser induzidos em laboratório. Em condições biológicas, após a capacitação a reação acrossômica, a ligação dos espermatozóides aos óvulos ocorre espontaneamente em até 10% dos espermatozóides. Algumas condições in vitro podem estimular a reação acrossômica, por exemplo: técnicas de processamento seminal, suplementação com fluido folicular, lisofosfatidilcolina, Ionoforo de cálcio, progesterona e glicoproteínas da zona pelúcida.

 

No entanto, estes testes são bastante trabalhosos e apenas avaliam um número limitado de espermatozóides que não representam necessariamente a fração responsável pela fertilização. Trata-se de um teste muito trabalhoso e que tem sido mais utilizado como ferramenta de pesquisa, porém em condições bem padronizadas de laboratório pode ser muito útil em determinar quais pacientes tem amostras seminais com incapacidade de sofrer os fenômenos de capacitação e reação acrossômica, mesmo tendo os todos os parâmetros seminais normais, incluindo-se até mesmo morfologia estrita de Kruger.

 

Teste de Capacitação Espermática (hiperativação)

Os espermatozóides são incapazes de penetrar o óvulo antes de passar pelo processo da capacitação. A capacitação é acessada bioquimicamente através da medida de receptores de superfície dos espermatozóides que se ligam à manose. Estes receptores estão intimamente relacionados com o reconhecimento da zona pelúcida. Este teste ainda se encontra na fase inicial de desenvolvimento. Alternativamente a capacitação pode ser avaliada pela incubação prolongada do sêmen com meio de cultura suplementado com proteína e mensuração do percentual de espermatozóides exibindo hiperativação na análise computadorizada(CASA).

 

Anormalidades na cromatina e dano no DNA do espermatozóides

A integridade do DNA é essencial para a transmissão de informações genéticas. Estudos demonstram que a fecundidade in-vivo diminui quando mais de 30% dos espermatozóides apresentam danos no DNA. Este é um fator independente das demais características da qualidade seminal (concentração, motilidade e morfologia) que pode oferecer informações referentes às probabilidades de gravidez in vivo ou in vitro. Além disso, fornece informações referentes às crianças nascidas assim como potencial fértil do homem com câncer. Desta forma, a pesquisa do dano no DNA é importante para avaliar casais com infertilidade idiopática e aqueles que serão submetidos a procedimentos de reprodução assistida. Substâncias como antioxidantes talvez possam ser úteis evitar as alterações no DNA de indivíduos inférteis.

 

Testes de interação espermatozóide – oócito

São diversos os testes de interação espermatozóide - oócito disponíveis atualmente, porém vamos nos ater aos três com maior experiência aceitação e correlação preditiva positiva com ciclos de fertilização in vitro: Teste da hemizona pelúcida humana, Teste da Penetração Espermática em óvulos de Hamster e Teste de Receptores de Manose. Como todos os testes de interação espermatozóide - oócito, faz-se necessário que o laboratório esteja extremamente treinado para sua correta realização e interpretação. Portanto, cada centro ou laboratório de reprodução dificilmente irá padronizar e disponibilizar mais que um dos testes acima descritos. Todos têm seus valores e são bons desde que haja total controle sobre cada etapa da realização do teste. Estes testes constituem um real avanço no diagnóstico de infertilidade, particularmente onde não há clareza sobre problemas no gameta masculino, morfologia normal e falhas de fertilização. Podem ajudar a indicar corretamente técnicas de baixa ou de alta complexidade onde os parâmetros habitualmente utilizados podem não ser representativos.

 

Teste da hemizona pelúcida humana (HZA)

Entre os vários testes para avaliar a capacidade de fertilização do gameta masculino, este representa, na atualidade, um dos que melhor mimetiza os fenômenos de ligação e penetração na zona pelúcida do oócito humano. Esse teste pode ser usado com valor preditivo tanto em reprodução natural como nas modalidades de reprodução assistida em que a aderência e penetração do gameta masculino no feminino se tornem necessárias.

 

Com auxílio do micromanipulador ou estereomicroscópio, um oócito é cortado em duas partes simétricas. Após o processamento do sêmen do paciente e de um doador conhecido (“swim-up”), os espermatozóides selecionados são adicionados a cada hemizona. As hemizonas são lavadas e é acessado o número de espermatozóides aderidos em cada hemizona. O resultado final é expresso na forma de um índice de penetração (HZI = hemizona index). Valor de referência: maior ou igual a 35%. Tem como inconveniente a necessidade de obtenção de oócitos humanos para ser realizado.

 

HZI = número de espermatozóides aderidos do paciente

                                               X

          número de espermatozóides aderidos do controle

 

Teste da Penetração Espermática em óvulos de Hamster (SPA)

Este teste é realizado usando óvulos de Hamster desnudados de sua zona pelúcida, porque assim eles perdem a sua habilidade de bloquear a polispermia e também a entrada de espermatozóides de outras espécies, tendo como vantagem sobre o Teste da Hemizona não precisar usar óvulos humanos para sua realização.

Este teste é expresso pela porcentagem de óvulos penetrados ou mais precisamente pelo Índice de Capacitação Espermática que deve ser superior a 5 penetrações por óvulo.

 

Teste de Receptores de Manose (MBA)

Este teste baseia-se no princípio que os espermatozóides hiperativos são aqueles que sofreram capacitação. Isto pode ser determinado por meio de parâmetros de velocidade mensurados no aparelho automatizado de análise seminal (CASA), ou bioquimicamente mensurando-se os receptores de manose. Foi demonstrado que os receptores de superfície do espermatozóide envolvidos no reconhecimento e ligação à zona pelúcida (ZP), são manose específicos. A ligação à ZP pode ser competitivamente bloqueada por lecitina ou concanavalina A. Foi demonstrado posteriormente que há uma alta correlação entre MBA e resultados de FIV clássica. A expressão dos receptores obviamente é avaliada na cabeça dos espermatozóides.

 

Conclusão

Fica claro que um único teste não pode predizer nem ter a pretensão de ser a solução para o diagnóstico exato da causa da infertilidade. Porém, simplificar a avaliação do homem a um simples espermograma e traçar condutas de tecnologia reprodutiva a partir da análise seminal simples, pode incorrer num erro maior devido à complexidade e diversidade das interações envolvidas antes e depois que um espermatozóide é ejaculado e até que ele encontre um óvulo e seja capaz de fertilizá-lo.

 

INFORMAÇÕES ADICIONAIS

 

Provas funcionais

Para que ocorra a fertilização não é suficiente o achado repetitivo de análises seminais dentro de limites normais. De fato, o espermatozóide, uma vez no trato feminino, deve ser capaz de atravessar a barreira endocervical, o útero e parte das tubas uterinas, para então mostrar sua capacidade de dispersar as células da granulosa, penetrar na zona pelúcida e fundir-se com o oolema. Todos esses eventos não são mostrados pela análise seminal, ficando assim estabelecida sua limitação em demonstrar a fertilidade do homem. Os testes funcionais com os espermatozóides objetivam evidenciar aspectos ligados aos fenômenos que se passam com os mesmos no trato feminino, basicamente a capacitação e a reação acrossômica. As indicações para cada um dos testes são específicas, dependendo não apenas do homem mas também de sua parceira, de modo que a indicação correta depende da avaliação do casal como uma unidade e dificilmente será acertada se for levado em consideração apenas um dos membros do casal.

A maioria dos testes descritos a seguir são utilizados em pesquisa em laboratórios de infertilidade, porém sua utilização rotineira na prática clínica é pequena.

 

Os principais testes funcionais são:

 

Testes de interação com o muco cervical - Os espermatozóides são colocados em contato com o muco cervical e, nesse ambiente, vai ser estudada sua progressão e viabilidade. Existem vários testes com essa finalidade:

  • Teste pós-coital (TPC)
  • Teste de interação entre lâmina e lamínula
  • Teste de Kremer, que permite avaliação semiquantitativa da interação

De toda forma, os testes são feitos utilizando-se o muco cervical da parceira no período periovulatório e os espermatozóides do companheiro. Uma interação deficiente provê subsídios para o diagnóstico de fator cervical como causa de infertilidade. Deve-se observar que, embora o homem tenha exame físico, análise seminal e hormônios normais, mesmo assim sua fertilidade em relação à sua parceira pode estar comprometida durante o processo de interação.

Provas imunológicas - Os espermatozóides são potencialmente antigênicos tanto para o homem como para a mulher. Para o próprio homem, essa capacidade antigênica ocorre porque estas células, além de serem haplóides, aparecem na puberdade, e o sistema imunológico reconhece os próprios antígenos no período perinatal. Do lado feminino, durante o período reprodutivo, a mulher é exposta a um grande estímulo antigênico no decorrer do ato sexual. O homem pode apresentar auto-anticorpos contra espermatozóides no líquido seminal e no sangue, e a mulher pode apresentar esses anticorpos no muco cervical, líquido folicular e no sangue. Assim, os anticorpos antiespermatozóides podem provocar a imobilização do gameta masculino ou impedir que ocorra a penetração no gameta feminino. Estes testes estão descritos no capítulo 4.

Teste da hemizona pelúcida humana - Entre os vários testes para avaliar a capacidade de fertilização do gameta masculino, este representa, na atualidade, o que melhor mimetiza os fenômenos de ligação e penetração na zona pelúcida do oócito humano. Nesse teste, os oócitos excedentes do programa de fertilização in vitro são inicialmente preservados em solução salina. Quando da realização do teste, um oócito é retirado da solução salina e transferido para uma gota de meio de cultura. Com auxílio do micromanipulador ou manualmente com o auxílio de um estereomicroscópio, o oócito é cortado em duas partes simétricas. Após o processamento do sêmen do paciente e de um doador conhecido (“swim-up”), os espermatozóides selecionados são adicionados a cada hemizona. A placa de cultura contendo as gotas é recoberta com óleo mineral e incubada a 37o C por quatro horas em estufa a 5% de CO2 em ar. Decorrido esse período, as hemizonas são lavadas com novo meio de cultura e a contagem do número de espermatozóides aderidos em cada hemizona é realizada com auxílio de microscópio invertido, com aumento de 400 vezes. O resultado final é expresso na forma de um índice de penetração (HZI = hemizona index).

 

HZI = número de espermatozóides aderidos do paciente

                                               X

          número de espermatozóides aderidos do controle

 

Valor de referência: maior ou igual a 35%

Esse teste pode ser usado com valor preditivo tanto em reprodução natural como nas modalidades de reprodução assistida em que a aderência e penetração do gameta masculino no feminino se tornem necessárias.

 

Outros testes funcionais - Dosagem dos níveis intracelulares da atividade enzimática da creatino-quinase, dosagem dos radicais livres de oxigênio, teste de reação acrossômica induzida, presença de receptores de D-manose etc.

 

Biópsia de testículo

Os achados histopatológicos mais freqüentes podem ser divididos em cinco itens:

 

a) espermatogênese normal;

 

b) hipoespermatogênese: redução quantitativa da linhagem germinativa no túbulo, que resulta em oligo ou azoospermia;

 

c) parada de maturação das células germinativas: em que existem apenas alguns estágios da meiose no epitélio germinativo, não se completando a formação até espermatozóide. Nesse caso, a análise seminal mostrará azoospermia;

 

d) aplasia germinativa (ou síndrome das células de Sertoli): aqui, não há epitélio germinativo e o túbulo é formado apenas por células de Sertoli. A análise seminal mostrará azoospermia;

 

e) hialinização testicular: substituição do túbulo seminífero, parcial ou totalmente, por substância hialina. Neste caso, conforme o grau de comprometimento, encontrar-se-á oligo ou azoospermia.

 

A biópsia de testículo é indicada apenas para diferenciar quadros de azoospermia obstrutiva daqueles pacientes com falência germinativa.

 

Nos casos de azoospermia não-obstrutiva, a biópsia tem valor preditivo para a obtenção de espermatozóides para ICSI, pois alguns indivíduos podem apresentar focos de espermatogênese. Na síndrome de células de Sertoli, a possibilidade de serem encontrados espermatozóides está em torno de 20% e na hipoespermatogenese essa chance é superior a 80%. Nas paradas de maturação, a chance é de cerca de 50%. Ressalta-se a importância da fixação das amostras em líquido de Bouin, para preservação da estrutura testicular.

 

Exames de Imagem

 

Ultra-som escrotal- empregado para avaliar o volume testicular quando este não for seguro ao exame físico.Sua realização é sugerida nos casos de oligozoospermia grave, azoospermia e alteração de consistência a palpação.O Eco doppler espermático para diagnostico não tem papel inicial.

 

Ultra-som transretal - Indicado na suspeita diagnóstica de obstrução dos ductos ejaculatórios e hipoplasia ou agenesia de vesícula seminal (azoospermia com volume ejaculado diminuído e PH ácido).

 

Vasografia ou deferentografia - Exame muito pouco utilizado atualmente, sendo indicado junto a procedimentos terapêuticos, como no auxílio da desobstrução do ducto ejaculatório por via transuretral. Uma outra indicação também poderia ser feita diante de pacientes azoospérmicos com todos os parâmetros laboratoriais normais e antecedentes de cirurgia inguinal bilateral.

 

Anamnese

 

Exame físico

 

Exames complementares

 

Avaliação mínima

  • Análise seminal - em pelo menos duas amostras.

Parâmetros mínimos de avaliação

 

  • Volume, cor, viscosidade, liquefação, pH, concentração, motilidade, vitalidade, concentração de células redondas; Morfologia de Kruger
  • Dosagens hormonais: FSH, testosterona.

Opcionais

 

  • Morfologia estrita;
  • Teste de processamento diagnóstico (“swim-up”, gradiente coloidal descontínuo);
  • Anticorpos antiespermatozóides no plasma seminal (MAR ou IBT direto);
  • Dosagens hormonais: estradiol, LH, testosterona livre e prolactina;
  • Testes de interação muco-sêmen;
  • Espermocultura;
  • Urocultura fracionada (Prova de Meares-Stamey);
  • Ultra-sonografia transretal (próstata e vesículas seminais);
  • Biópsia testicular.

Excepcionais

 

  • Ultra-sonografia abdominal (aparelho urinário);
  • Radiografia de sela túrcica (hiperprolactinemia);
  • Teste da hemizona pelúcida humana;
  • Outros testes funcionais.